肺动脉高压是一种快速进展、危及生命且通常致命的疾病。尽管肺动脉高压（PAH）治疗取得了许多新进展，但目前尚无治愈PAH的方法，迫切需要新的疗法。PAH的病理生物学涉及肺动脉的重塑过程，该过程在升高肺动脉压和右心室压力中起着关键作用。新疗法的发现和开发需要模拟人类疾病（包括血管重塑）的PAH动物模型。本文我们回顾并详细描述了在小鼠中建立5416/低氧诱导的PAH体内模型的方案，该模型常用于评估PAH新疗法的效果。使用该方案可在1个月内建立严重的肺动脉高压。此外还提供了通过有创压力测量和组织学评估该模型的附加方案。
一、引言
肺动脉高压（PAH）的血流动力学定义标准为：通过右心导管检查评估，静息时平均肺动脉压大于25 mmHg。PAH是一种心肺疾病，其特征是远端肺动脉进行性血管重塑，导致肺动脉压升高，进而引起右心室超负荷，并最终因右心衰竭而死亡。PAH中的血管重塑是内皮功能障碍、平滑肌细胞病理性增殖和迁移、炎症及血栓形成的结果。
目前靶向PAH疾病发病机制相关通路的疗法改善了PAH患者的生活质量和临床结局；然而，目前尚无治愈PAH的方法。能够逆转肺动脉高压期间肺血管重塑的新治疗方法正在积极研究中。
为了评估新疗法对PAH的疗效，需要能够再现人类疾病关键病理生理特征的临床前模型。肺动脉高压患者血管重塑的特征性表现包括新生内膜增生、肺小动脉中膜和外膜增厚、复杂丛状病变形成以及毛细血管闭塞。
与人类疾病不同，啮齿类动物PAH模型（例如用野百合碱处理大鼠）缺乏与人类PAH发病机制相关的重塑过程和丛状病变。本方案中描述的一种新型小鼠PAH模型，虽然不能完全复现严重的人类PAH，但展示了人类疾病的许多特征。联合使用5416（一种血管内皮生长因子抑制剂）与慢性低氧暴露已被证实可引起伴有血管闭塞性病变的严重PAH，这些病变与PAH患者的丛状病变相当。
本文我们描述了通过联合慢性低氧和每周注射5416在小鼠中诱导PAH的方法，随后进行血流动力学参数测量和组织学PAH特征分析。使用该方案可在1个月内建立严重的肺动脉高压。
二、材料
2.1 动物
雄性C57BL/6小鼠。啮齿动物饲料。饮水瓶。啮齿动物笼具。啮齿动物垫料。2.2 肺动脉高压诱导
半密封低氧舱（BioSpheri）。氮气罐。氧气控制器。分析天平。5416。二甲基亚砜。磷酸盐缓冲液。无菌1毫升注射器。25G × 5/8英寸针头。2.3 肺动脉高压功能鉴定
带盖麻醉罐。异氟烷。加热垫。胶带。无菌缝合包。22G聚乙烯导管。机械通气/呼吸机系统和氧气罐。棉签。25G × 5/8英寸针头。手术器械：小血管烧灼器、钝头剪刀、钝头拇指镊、弹性钩式牵开器。压力-容积控制单元。压力-容积数据采集与分析软件。小鼠1.2F压力-容积导管。2.4 肺动脉高压组织学鉴定
50% O.C.T./PBS：O.C.T.包埋剂、PBS。一次性包埋模具。干冰。低温恒温器。聚-L-赖氨酸处理的玻璃显微镜载玻片。4%多聚甲醛溶液。苏木精。伊红。山羊血清。一抗。二抗-荧光染料偶联物。4,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐。封片剂。盖玻片。明视野显微镜和共聚焦显微镜。三、方法
3.1 动物
接收动物后，将其群养（每笼五只）于配有适当垫料、啮齿动物饲料和水的通风啮齿动物笼具中（见注释1）。让它们适应新环境（18–20°C、40–50%湿度、12小时光/暗循环）至少3天。称量动物体重，并将其随机分配到各处理组：常氧组、低氧组或低氧+5416组。每隔一天监测体重、食物和水的消耗量。3.2 肺动脉高压诱导
称量动物体重并准备注射用5416。将结晶态5416溶解于DMSO中，浓度为20 mg/mL。然后用PBS按1:3稀释5416溶液（DMSO:PBS）。将pH调节至7.2（见注释2）。使用带有25G × 5/8英寸针头的1毫升注射器，在连续三周内每周一次，以20 mg/kg的剂量在低氧+5416组动物的腹部区域皮下注射5416。给常氧组和低氧组动物单独注射溶剂（图1）。如图2a和b所示设置半密封低氧舱、氧气控制器和氮气罐。在氧气控制器上设定10% O₂的设定点，让系统达到稳态（见注释3）。将低氧组和低氧+5416组动物维持在常压低氧（10% O₂）条件下3周。在低氧环境中暴露3周后，将低氧组和低氧+5416组动物置于常氧（21% O₂）条件下再饲养一周（见注释4）。可每隔3天打开舱体30分钟，用于清洁笼具并补充食物和水。将常氧组动物饲养在半密封舱内、21% O₂条件下，持续4周。在低氧暴露期间，每日观察动物是否有痛苦迹象，如竖毛、体重减轻和呼吸困难（见注释5）。如果动物无法进食或活动且无明显迅速改善，且无法纠正其痛苦状态，则应实施安乐死。图1. 实验设计。所有动物组在肺动脉高压诱导期间处理方案和氧浓度暴露的示意图。Nox：常氧，Hy：低氧，HySU：低氧 + 5416，SU：5416
图2. 肺动脉高压诱导的实验装置。(a) 低氧系统示意图。装置显示如BioSpheri研究工具公司所示。ProOx P360检测O₂浓度的变化，并通过气体注入管注入控制气体进行校正。(b) BioSpheri系统的照片。本实验室安装的系统能够在每个低氧舱中同时容纳最多六个笼具。
3.3 肺动脉高压功能鉴定
在麻醉前记录每只小鼠的体重和健康状况。在麻醉罐中用3–4%异氟烷对小鼠进行预麻醉（1升罐中加入0.20毫升异氟烷）。通过施加伤害性刺激（如夹尾）确认麻醉适当。用毛发推剪剃除动物胸部和颈部的毛。将缝合线固定在小鼠的上门齿并固定在加热垫上，使小鼠颈部向上伸直。将动物仰卧固定，上下肢用胶带固定在加热垫上。用酒精清洁手术部位（颈部和胸部）。小鼠头部朝向操作者，在颈部正中皮肤做1厘米切口。分离甲状腺叶，暴露气管。用无创镊小心拉出舌头并向上移动。经口用22G聚乙烯导管对动物进行插管。通过颈部切口检查导管是否正确放置在气管内（见注释6）。通过改良的Y型连接器将导管连接到机械通气机，在整个手术过程中维持小鼠吸入2%异氟烷。通气参数：潮气量0.12毫升，通气频率148次/分钟。手术开始前，将1.2F压力-容积导管的尖端置于PBS中浸泡30分钟。打开压力-容积控制单元并启动数据采集软件。在体温条件下用PBS校准导管（见注释7）。在下胸部区域做皮肤切口。将皮肤与胸壁分离，打开胸骨柄旁的腹壁（见注释8）。使用弹性钩式牵开器固定肋骨。剪开膈肌，暴露心脏。用棉签清洁该区域并打开心包。用连接棉签的25G × 5/8英寸针头在心尖处刺入右心室。从右心室取出针头，借助钝头拇指镊将1.2F压力-容积导管通过刺孔朝肺动脉方向插入。确保导管的远端电极完全被右心室肌肉包围（见注释9）。记录所有数据，每只小鼠至少采集五个右心室收缩压值并取平均值（图3a）。小心地从右心室取出压力-容积导管，并将其置于PBS溶液中（见注释10）。记录压力后，从左心室灌注5毫升PBS以清除体循环中的血液（见注释11）。分离心脏并摘除两个心房。小心地将右心室与左心室和室间隔分离并称重。使用富尔顿指数（计算为右心室重量/左心室+室间隔重量；图3b）评估右心室肥厚。如图3所示，VEGFR1抑制加剧了慢性低氧诱导的右心室压力和肥厚。深圳市富临神通科技有限公司是BioSpheri中国代理商，富临神通为中国客户提供：动态环境控制器、气体控制系统、细胞培养箱、动物实验舱等产品。
图3. 肺动脉高压功能鉴定。在慢性低氧或慢性低氧+5416暴露3周并随后常氧饲养1周后，测定右心室收缩压（a）和富尔顿指数（b），并与暴露于常氧4周的对照动物进行比较。与低氧组相比，*P < 0.05，**P < 0.01（采用单因素方差分析和Bonferroni事后检验）；每组n = 5。Nox：常氧对照组，Hy：低氧组，HySU：低氧+5416组
3.4 肺动脉高压组织学鉴定
将肺从其他器官和组织中分离出来。制备50% O.C.T./PBS溶液，并对肺进行吹灌（见注释12）。将肺置于预先填充O.C.T.的一次性包埋模具中，在干冰上速冻。冷冻后将样品保存于-80°C。用低温恒温器将肺切成8微米厚的切片（见注释13），并贴在聚-L-赖氨酸处理的载玻片上。室温下风干切片30分钟。用4% PFA固定切片10分钟。对于肺的形态学分析和中膜厚度评估，进行苏木精和伊红染色（图4）。对于免疫组织化学，固定切片后，在Dako溶液中的10%山羊血清中封闭1小时。例如，可使用α-平滑肌肌动蛋白抗体来确认中膜肥厚。用PBS冲洗切片三次，每次5分钟。将一抗稀释于Dako溶液中的1.5%山羊血清中，在湿盒中于4°C孵育切片过夜。用PBS冲洗切片三次，每次5分钟。加入二抗-荧光染料偶联物（稀释于Dako溶液中的1%山羊血清中），在湿盒中于37°C孵育45–60分钟。用PBS冲洗切片三次，每次5分钟。用DAPI溶液孵育切片5分钟。用PBS冲洗切片一次。滴加一滴封片剂封片。用指甲油密封盖玻片。用共聚焦显微镜观察封好的玻片。长期储存时，将玻片在4°C下避光保存。图4. 肺动脉高压组织学特征。所示处理组的代表性肺切片经苏木精/伊红染色。对肺切片进行染色，用于形态学分析和中膜厚度评估。比例尺：50微米
四、注释
雄性C57BL/6小鼠（8–10周龄）购自一家经美国农业部许可的商业供应商。所有使用动物的方案均按照美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》执行，并获得了西奈山伊坎医学院机构动物护理与使用委员会的批准。以结晶固体形式提供的5416不溶于水溶液。然而，与羧甲基纤维素相比，100% DMSO等有机溶剂能够在小体积内完全溶解5416。氧气控制器可检测半密封低氧舱内O₂浓度的变化，并通过气体注入管注入富氧或贫氧控制气体（N₂）进行校正。舱体通风由风扇被动控制，保持空气流通，舱体侧面的开孔允许陈旧空气被替换。舱内和舱外压力保持相同（常压条件）。N₂的消耗量取决于O₂设定点和低氧舱的大小。为了诱导中重度肺动脉高压（低氧+5416组），小鼠每周一次皮下注射5416（20 mg/kg），并在常压低氧（10% O₂）条件下暴露3周，随后在常氧条件（21% O₂）下饲养一周。轻中度肺动脉高压（低氧组）通过将动物置于慢性常压低氧中3周，随后在常氧中饲养1周来诱导。从第一周开始，可观察到暴露于低氧的动物体重下降。这些动物体重减少10%是疾病发展的可靠指征。通过导管手动向肺部吹气，再次确认插管操作是否正确。您应观察到胸腔容积增加。使用一个装有37°C PBS的15毫升试管。调零时，将导管保持在水面下几毫米处。然后将导管浸没到一定深度并检查压力；每浸没一厘米水深度，输出压力应为0.75 mmHg。在外科手术过程中避免出血极为重要，因为大量失血可能影响血流动力学参数测量。如果手术过程中血管受损，使用小血管烧灼器止血。此步骤至关重要，1.2F压力-容积导管的所有电极必须浸入右心室腔内。在开始记录压力数据前，让压力-容积导管在右心室内稳定5分钟。如果压力-容积导管位置不当，信号可能会失真。将压力-容积导管调整至右心室内更中心的位置，并检查信号是否稳定。在数据记录前几秒至记录期间关闭呼吸机，可获得最佳数据记录效果。为妥善维护压力-容积导管，将其置于装有PBS的15毫升试管中。实验结束后清洁并消毒。为了更好地暴露心脏，通过肋骨做两个侧向切口直至锁骨，然后向上抬起胸骨。在右心房做一切口，使血液流出循环系统。为妥善保存肺的生理结构，需要在速冻前用50% O.C.T./PBS溶液对肺进行吹灌。如果所有肺部都用于组织学研究，可通过气管进行肺吹灌。否则，可使用1毫升注射器和27G针头用50% O.C.T.溶液吹灌肺。将低温恒温器温度设置为-20°C。开始切片前，让含有肺样品的O.C.T.包埋块回温。如果包埋块太冷，标本会卷曲；如果太热，则会粘在刀片上。未固定的载玻片可在-80°C下保存数月。名鼎配资官网提示：文章来自网络，不代表本站观点。
